Elektroforeza

Elektroforeza to rozdział mieszaniny związków chemicznych w polu elektrycznym. Technika ta jest wykorzystywana do separacji związków chemicznych i biomolekuł. Pod wpływem pola elektromagnetycznego następuje ruch wszystkich jonów, w tym także elektrolitu w kierunku elektrod o przeciwnym ładunku. Cząsteczki wody, występujące w przyrodzie w postaci dipoli, wiążą się za pomocą oddziaływań elektrostatycznych z makrojonami lub jonami tworząc otoczkę hydratacyjną. Wpływa ona na możliwości ruchu cząsteczki w środowisku wodnym.

Na ruchliwość jonów mają przede wszystkim wpływ:

rozmiar makrojonu (masa cząsteczkowa)
gromadzony na cząsteczce ładunek elektryczny,
właściwości elektrolitu (rodzaj buforu - stężenie, siła jonowa, wartości pH)
temperatura w której prowadzony jest eksperyment
natężenie pola elektrycznego

Za pomocą technik elektroforetycznych możemy badać DNA, białka, peptydy, aminokwasy, jak również wykonywać testy na obecność narkotyków, pestycydów poprzez wykrywanie kwasów organicznych i zasad.

Przykłady zastosowań elektroforezy:

preparatywny i ilościowy rozdział cząsteczek w celu uzyskania czystych frakcji
określenie czystości i jednorodności badanych substancji
wyznaczanie masy cząsteczkowej i punktu izoelektrycznego badanych substancji tzw. elektroforeza 1D i 2D
do celów diagnostycznych i badawczych

Elektroforeza może być prowadzona w warunkach:

denaturujących – w żelu poliakrylamidowym, gdzie zostają zniszczone struktury wyższego rzędu
nie denaturujących – w żelu agarozowym z zachowaniem struktur 2-, 3- i 4-rzędowych

Elektroforeza DNA w żelu agarozowym

Cząsteczki migrują w żelu o określonym usieciowieniu. Gęstość tego usieciowienia, czyli wielkość porów określa zdolność rozdzielczą żelu. Zależy ona ściśle od stężenia agarozy. Im wyższe stężenie, tym gęstsze usieciowanie, a tym samym dokładniejszy rozdział cząsteczek o masie różniącej się nieznacznie.

Do analizy DNA wielkości od kilkuset do kilku tysięcy par zasad stosuje się głównie żele agarozowe o stężeniu 0,7% - 1,2%. Taki żel umożliwia rozdzielenie m.in. DNA o masie od 30 do 20 000 par zasad.

Rys. Aparat do elektroforezy w żelu agarozowym.

Agaroza jest to naturalny polisacharyd wyizolowany ze ściany komórkowej krasnorostów należących do rodzajów Gelidium, Gelidella, Pterocladia, Gracillaria i Ahnfeltia. Roztwór agarozy do żeli preparatywnych jest łatwy do przygotowania. Agaroza szybko rozpuszcza się w buforze do elektroforezy pod wpływem ogrzewania, dzięki występowaniu w strukturze wiązań wodorowych. Brak grup jonowych sprawia, że agaroza ma ładunek obojętny. Zapobiega to interakcjom z hydrofilowymi cząsteczkami, podczas rozdziału elektroforetycznego. DNA migruje w żelu pod wpływem prądu. Dłuższe fragmenty o większej masie, przeciskając się przez siateczkę żelu napotykają większy opór, dlatego ich przemieszczanie zachodzi wolniej. Cząsteczki o tej samej wielkości i obdarzone tym samym ładunkiem migrują w tym samym tempie. Aby zidentyfikować wielkość cząsteczek DNA w prążkach, na żel nakłada się standardy wielkości – mieszaninę DNA o znanych długościach łańcucha. Porównując prążki z badanej próbki z prążkami standardu jesteśmy w stanie określić wielkość cząsteczek DNA w badanej próbce.

Próbki DNA, które nakładamy na żel zawierają barwnik, który nie barwi DNA, jedynie ułatwia nam nakładanie próbek do studzienek w żelu. Obdarzony ładunkiem ujemnym barwnik podobnie jak cząsteczki DNA migruje w stronę bieguna dodatniego informując obserwatora o postępie rozdziału.

Aby zobaczyć wynik rozdziału DNA na żelu agarozowym należy żel wybarwić w substancji, która wiąże się z kwasem deoksynukleinowym. W tym celu w laboratorium często stosowany jest bromek etydyny, który wnika w głąb struktury DNA, a następnie po nad wpływem światła UV świeci na pomarańczowo.

Zaletami agarozy są łatwość sporządzania żelu, możliwość jego wielokrotnego wykorzystania i czuła detekcja DNA wybarwionego bromkiem etydyny. Do wad możemy zaliczyć stosunkowo wysoki koszt oznaczenia i brak możliwości srebrzenia.

Metodę tą stosuje się do rozdzielania, analizy i oczyszczania kwasów nukleinowych i białek. Technika ta stosowana jest również do sprawdzenia czy uzyskano produkt reakcji PCR oraz produkt późniejszego trawienia enzymami restrykcyjnymi.

Elektroforeza DNA w żelu poliakrylamidowym

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym podobnie jak w agarozie polega na rozdziale naładowanych cząsteczek w polu elektrycznym. Cząsteczki migrują do przeciwnie naładowanej elektrody z różną szybkością zależną od wielkości cząsteczki oraz jej ładunku. Elektroforeza zależy od rodzaju buforu, jego stężenia oraz pH, temperatury, natężenia pola.

W żelach poliakrylamidowych nośnikiem jest spolimeryzowana mieszanina akrylamidu (CH2=CHCONH2) i metylenobisakryloamid (CH2(NHCOCH=CH2)2). Katalizatorem reakcji polimeryzacji jest N,N,N`,N`-tetrametyloetylenodiamina (TEMED), a inicjatorem nadsiarczan amonu (APS). Rozdzielczość żeli jest bardzo duża. Zaletami żelu poliakryloamidowego są niskie koszty oraz możliwość wybarwiania rozdzielonych frakcji DNA poprzez srebrzenie, które daje wyraźne, widoczne gołym okiem i trwałe obrazy. Wady to jednorazowe użycie żelu, silna neurotoksyczność monomerów oraz słabsze niż w przypadku żelu agarozowego wybarwianie DNA przy pomocy bromku etydyny.